HemNär man odlar orkidéer in-vitro är det viktigt att arbeta axeniskt. Utrustning, instrument och arbetsytor måste steriliseras för att inte smitta känsliga kulturer med bakterier eller sporer. kontaminanter som lyckas ta sig in i en flaska kan förstöra kulturen totalt.
Ett orkidémedium som innehåller socker (2-3%), vitaminer, och en mängd mikro- och makronäringsämnen; som dessutom hålls fuktigt och varmt, utgör en perfekt miljö för mängder av vanliga mikrober. Sporer och bakterier finns naturligt i luften och sprids mycket lätt.
Det finns olika sätt att arbeta sterilt. Det absolut bästa sättet är det som fungerar!
Att arbeta direkt över en bänk kan vara mycket riskabelt. Det är
mycket svårt att hålla instrument, behållare, medium och växtdelar
sterila. Det är viktigt att följa enklare regler vid allt sterilarbete:
En gas- eller spritbrännare används lämpligen till flambering av instrument och för att skapa en het uppåtströmmande luftpelare som avdödar och avlägsnar luftburna mikrober från arbetsområdet.
En sterilbänk (LAF) används
av seriösa orkidéodlare. Det är en bänk med väggar
och tak (öppen framtill). En kontinuerlig ström av filtrerad luft
blåser mot öppningen. Luften filtreras med ett s.k. HEPA-filter
som stoppar alla luftburna partiklar på ca 0,3µm i storlek (exempelvis
sporer). Detta gör att bänken hålls steril, men det gäller
att arbeta rätt (hålla händerna i styr). Bänken ger mycket
frihet.
Allt inuti sterilbänken steriliseras innan arbetet påbörjas (väggar, inredning, instrument m.m.). Man kan använda sig av kemisk sterilisering och/eller UV-strålning. Förövrigt ska allt som tas in i den sterila miljön steriliseras. Så fort som något avlägsnats från bänken betraktas det som kontaminerat! När man arbetar i bänken ser man till att inte föra händer bakom behållare och känsliga objekt (kontaminationer från händer m.m. kan lossna på pga. luftströmmen och hamna i känsliga odlingar).
Ett
mindre akvarium eller terrarium (ca 60dm³) kan vältas åt sidan,
steriliseras invändigt och användas som "sterilt rum" för
sterilarbete. Givetvis kan man bygga en egen enkel låda för detta
(en genomskinlig plastpåse och en wellpapplåda). Långa gummihandskar
kan sättas fast vid hål i "frontpanelen" (räkna med
att konstruera en egen). Ett annat alternativ är att dränka in en
trasa med lämpligt sterilisationsmedel (ex. 1:10 blekmedel:vatten; dvs.
1% NaOCl) och sedan hänga denna över öppningen, likt ett draperi,
vid sterilarbetet. Skyddet hindrar luftströmmar som kan bära kontaminanter
från att ta sig in när man sitter och arbetar. Alla instrument som
används måste steriliseras innan de förs in i det sterila området.
För att denna metod ska vara säker måste man placera sterila instrument (ex. inslagna i aluminiumfolie), prover, kemikalier och explant i lådan innan arbetet påbörjas. Därefter steriliseras allt en gång till, efter förslutningen av lådan. 1% natriumhypoklorit kan ex. sprayas inifrån efter förslutningen. Man kan placera en behållare med ca. 5% natriumhypoklorit och efter lådans förslutning droppa i ett par droppar koncentrerad saltsyra (HCl) för att få en gasutveckling (klorgas) som steriliserar utrymmet.
Ett sätt att arbeta sterilt är att utföra jobbet ovanför en behållare med sjudande eller kokande vatten. I vattenånga (120°C) är miljön praktiskt taget steril. Det skapas en strid (och het) uppåtriktad ström av vatten och luft. Ett stålgaller läggs lämpligen över vattenbehållarens kanter. På gallret har man en stabil plats att lägga instrument, lock och korkar samt ställa behållare på. Allt som förs utanför ångan skall betraktas som kontaminerat. Flambera instrument kontinuerligt under arbetet. Med tystnad och lugna rörelser har man ett fördelaktigt beteende.
Hypoklorit oxiderar och förstör organiska material. Natriumhypoklorit är lättillgängligt, effektivt och billigt (säljs under namnet klorin). Vid kloning av en växt, med växtexplant som utgångspunkt, brukar sterilisationstiden vara runt 15 minuter, för en 1% NaOCl-lösning. Blekmedel (ex. klorin) är en ungefärlig 5% natriumhypokloritlösning och bör därför spädas med vatten till 20% (dvs. till 1% NaOCl; 1 del blekmedel och 4 delar vatten). Ibland används ännu svagare koncentrationer, ex. 10% (0,5% NaOCl; 1 del blekmedel och 9 delar vatten).
Tillsätt också lite av en ytaktiv substans, diskmedel eller liknande (Tween 20/40 eller YES). Det är användbart för att sterilisationsmedlet lättare och bättre ska flyta ut över explantet för att få kontakt. Därmed blir det en effektivare sterilisering.
Kalciumhypoklorit (Ca(ClO)2) kan även användas. Många som mikroförökar använder sig hellre av kalciumhypoklorit än natriumhypoklorit. Lösningar tillreds från pulver och blir renare lösningar än ex. blekmedel som inte bara innehåller natriumhypoklorit. Kalciumhypoklorit säljs för rengöring av badbassänger. Ungefär 35g/L vikt/volym i destillerat vatten, är lämpligt för sterilisering av frön (ca 5 min.). Väteperoxid (H2O2) är ett möjligt desinfektionsmedel ([2-3%]; 10 minuter). Fördelen med väteperoxiden är att möjliga rester av det sönderfaller till vatten.
Innan växtdelarna (frö eller explant) introduceras till mediumet bör de sköljas av i sterilt destillerat vatten. Destillerat vatten kan köpas på apoteket som 'renat' vatten (Aqua purificata Eur), men det är billigare att köpa 'batterivatten' på en bensinmack. Vattnet måste steriliseras innan det används för kultur. Lämpligen tryckkokas vattnet i mindre flaskor eller burkar (fyllda till 2/3) under 20 minuter (det går att låta dem stå i 150°C ugn, 2-3h).
Tabell* över ungefärlig sterilisationstid för växtexplant (*källa: Sigma Aldrich).
Kemikalie |
Koncentration (%) |
Tid (min) |
Återförsäljare |
Kalciumhypoklorit, Ca(ClO)2 |
9-10 |
5-30 |
Färghandel med pooltillbehör |
Natriumhypoklorit, NaOCl |
0.5-5 |
5-30 |
Livsmedelsbutiker, färghandel |
Väteperoxid |
3-12 |
5-15 |
Apotek, viss färghandel |
Etanol |
70-95 |
snabbt |
Bensinmack, färghandel |
Isopropylalkohol |
70-95 |
snabbt |
Apotek |
Effektiv avdödning av mikroorganismer och sporer åstadkommer man
genom att autoklavera instrument, odlingskärl och medium. Man kan använda
en gammal tryckkokare, det blir samma effekt. Det är viktigt att autoklaven
eller tryckkokaren får komma upp i tryck och att man har fyllt på
med en tillräcklig mängd vatten för att en kraftig ånga
och ett stabilt tryck ska kunna hållas under åtminstone 15 minuter.
Autoklaven eller tryckkokaren låts sedan svalna av; trycket sänks
och steriliseringen är över.
Det är trycket och ångan som gör autoklaven så effektivt. Våt värme fungerar bättre än torr och det höga trycket gör att temperaturen hålls på 121°C. Mängden vatten som tryckkokaren bör fyllas på med får helt enkelt provas fram. Medium som ska autoklaveras fördelas ut i rena odlingskärl från början (små mängder i många kärl innebär en bättra sterilisering). Mynningar kan stoppas med bomull och täckas med aluminiumfolie. (Tänk på att inte fylla flaskor och behållare som ska autoklaveras, med mer vätska än den mängd som når till omkring halva höjden av flaskan eller behållaren.) Innan tryckventilen (dvs. "tyngden") hängs på måste man låta den varma luften utrymma autoklaven (som ska fyllas med ånga).
En ugn är mycket användbar när man behöver sterilisera metallinstrument (saxar, pincetter m.m.). Rena instrument slås in i aluminiumfolie, eller placeras i en plåt ask, och bakas i 150°C (2-3 timmar). Medium kan givetvis också steriliseras på detta sätt.
Det finns 'hemmaodlare' (och proffs) som använder mikron till att sterilisera (framförallt medium och vätskor). Metall kan inte köras i mikrovågsugnen.
UV-ljus avdödar mikroorganismer och används för att sterilisera arbetsbänk och andra sterila områden. Det tar tid att sterilisera med UV och kan alvarligt skada människor, växter och andra levande organismer. Många kemikalier och material kan också påverkas av exponeringen.
Solljus har i vissa fall använts för att avdöda viss förekomst av kontamination i nysådda eller nyligen ympade kolvar. Man måste vara varsam så att temperaturen i kolven inte blir för hög. (Växten kan dö av värmen eller brännas av ett allt för starkt ljus.)
Orkidéfrön
är ytterst små (som dammkorn). Torkade frön är kontaminerade.
Frökapseln spricker när den låts torka och dess innehåll,
fröna, måste därför steriliseras innan de sås på
medium. Kemiska steriliseringsmedel används vanligen. Det finns några
olika metoder för att sterilisera frön:
Det enklaste sättet att sterilisera frön är att placera dem i exempelvis en liten mätcylinder eller i ett provrör, sätta till steriliserande lösning, skaka om något och efter en stund skölja av fröna med sterilt vatten. De är sedan färdiga för sådd på näringsmedium.
Känsligare (dyrbara) orkidéfrön brukar man vika in i ett litet paket av filtrerpapper. Pappret sätts ihop (kan ex. nitas ihop) och dränks in i steriliserande vätska. Efter sterilisation sköljs paketet av genom att man låter det dra i sterilt destillerat eller sterilt R/O-vatten.
Under sterila förhållanden öppnas paketet och fröna kan sås med hjälp av exempelvis en platinaöggla.
Med en liten spruta kan man relativt lätt sterilisera frön. Sprutor är generellt sett sterila då de köps och många kan dessutom autoklaveras för att undvika eventuella kontaminanter. Frön placeras i en mindre spruta (5-10ml) och steriliserande vätska sugs upp. Sprutan kan lätt skakas om och vätskan kan förhoppningsvis sprutas ut utan att fröna lämnar sprutan. Man kan suga upp steriliserande lösning upprepade gånger och sedan, på samma sätt, skölja av fröna upprepade gånger med sterilt vatten.
Det finns odlare som föredrar att förbehandla frön med sockerlösning för att väcka inaktiva mikrober (ex. från sporform). Det kan nämligen vara svårt att avdöda vissa stammar av bakterier och svampar då de vilar som sporer.
Lämplig sockerkoncentration på lösningen är ungefär halva koncentrationen av en mättad lösning (dvs. 1 del mättad sockerlösning till 1 del rent vatten). Lösningen med frön inkuberas i rumstemperatur i 12-24 timmar och skakas om försiktigt en gång i timmen.
När kontaminanterna är aktiverade kan de avdödas kemiskt.
En frökapsel behöver inte mogna helt för att vara användbar till sådd. När kapseln torkar spricker den och blir omedelbart kontaminerad inuti. Frön är relativt känsliga för sterilisering och det kan därför vara värt att plocka kapseln innan den är riktigt mogen och sterilisera den. Kapseln kan sedan öppnas i sterila förhållanden och frön kan plockas ur den sterila fruktkroppen.
Hela kapseln tvättas av med något diskmedel och steriliseras ex. med natriumhypoklorit (blekmedel; outspädd) i 30 minuter. Kapseln kan sedan doppas i koncentrerad alkohol, flamberas och slutligen öppnas för sådd. Tiden för en kapsel att mogna på plantan varierar kraftigt mellan olika orkidéer (allt från 3 till 10 månader (en del ca 20 månader)).
Aluminiumfolie är en utomordentlig hjälp vid sterilarbete.
Som nämnt ovan kan aluminiumfolie autoklaveras som ett paket och vecklas ut för användning som en steril arbetsyta. Ett annat sätt är att använda en duk, en trasa eller ett filterpapper, indränkt i 70% alkohol, att arbeta på.
För att lätt kunna sterilisera explant (ex. vid kloning), istället för att krångla med en pincett eller liknande instrument, kan en thesil användas för att riktigt dränka växtdelarna.
En sprayflaska kan vara användbar för att sterilisera ytor och inredning av skåp m.m. Lämplig steriliserande vätska fylls helt enkelt på och sprayas ut över önskad yta. 10% blekmedel kan exempelvis sprayas ut (ibland tillsätts en mindre mängd utspädd ättiksyra (CH3COOH) (byt ut en del vatten mot 12%ig syra: 1 del blekmedel, 1 del 12% ättiksyra och 8 delar vatten + lite diskmedel). Det gäller givetvis att vara mycket varsam när man handskas med kemikalier på det här viset. Blekmedel kan inte bara bleka föremåls färger, det är inte nyttigt att få på sig och giftigt att få i sig. Luftvägarna mår inte bra av att man andas ner de flyktiga ångorna.
Sprit (etanol eller isopropanol) kan även sprayas. Lägre koncentrationer lämnar mer vatten efter dunstning, högre koncentrationer dunstar mycket snabbt och kostar mer att spraya. Alkohol är effektivt men man bör vara mycket varsam. Det kan skada personen som hanterar den (ögon, hud, luftvägar etc.). Högre koncentrationer av sprit brinner bra. Det är viktigt att metanol inte används (giftigt).
Copyrights © Reserved Markus Axelsson, 2005. 